哮喘是由多种炎症细胞和细胞组份参与的气道慢性炎症疾患。近年来，随着研究的深入，Th1/Th2细胞比例失衡是哮喘主要发病机制的观点越来越被多数学者所接受。目前已证明IL-12和IL-4分别是Th1/Th2分泌的炎症抑制因子/炎症促进因子，亦是诱导Th0向Th1/Th2分化的关键因子 [1] 。卡介苗(BCG)作为免疫调节剂，能诱导γ-干扰素的产生和Th1细胞的增殖活化 [2] 。本研究旨在观察哮喘大鼠气道中IL-12、IL-4浓度变化和气道炎症反应，以及致敏期间用BCG衍生物(BCG-PSN)干预后对其的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 Wistar雄性大鼠(月龄2～3个月，体重200±50g)18只(购于中南大学动物部)，随机分3组:对照组(A组)，哮喘组(B组)，BCG-PSN干预组(C组)。卵蛋白粉(OVA武汉博士德公司)，大鼠IL-12、IL-4酶联免疫(ELISA)试剂盒(上海森雄公司)，Optirep液(挪威Axis-shield公司)，酶标仪(EL×800，美国Bio-Tekinstrument INC)，Epics Altra型流式细胞仪(美国BECMAN COULTER公司)，BCG-PSN(陕西生物制品研究所)，402A雾化器(江苏鱼跃医疗设备有限公司)，显微镜(Nikon)，离心机(美国Sigma公司)，自制雾化吸入箱，Al(OH) 3 (本校免疫室)。
1.2 方法
1.2.1 哮喘模型的建立 [3] B组:第1～7天分别腹腔注射含OVA10mg、Al(OH) 3 200mg的混悬液2ml致敏，第8天开始以1%OVA液雾化吸入，每天1次，每次60min，连续7天;A组:用生理盐水代替OVA和AL(OH) 3 ，余处理同B组;C组:在致敏期间每天腹腔注射1次BCG-PSN(0.025g/kg)，余处理同B组。
1.2.2 支气管肺泡灌洗液(BALF)收集 各组大鼠末次激发24h后用戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉，在环状软骨上用止血钳固定，其下方作横切口，置入连接注射器的硅胶管，分3次注入37℃生理盐水各1ml，并立即回收BALF(回收率70%左右)。
1.2.3 IL-12、IL-4浓度测定 将BALF1.5ml以1500r/min离心10min，取上清液贮存于-20℃冰箱，在1个月内用ELISA法按操作说明测定IL-12、IL-4浓度。重悬液2h内作细胞计数、EOS数及EOS凋亡率。
1.2.4 炎症细胞总数、EOS数测定 依照参考文献 [4] 取重悬液0.1ml，用计数板直接计数炎症细胞总数，用重悬液50μl，按1:5比例加EOS稀释液，用计数板直接计EOS数。
1.2.5 EOS凋亡率测定 依照参考文献 [5] 自制密度为1.09kg/L和1.08kg/L的Optirep液各1.5ml，先后加入离心管。取重悬液1.0ml，用等量生理盐水稀释，离心洗涤2次后，生理盐水重悬细胞，用350目尼龙筛过滤，取滤液沿壁轻轻加入上述离心管，以2000r/min离心20min。收集中间层细胞，测定EOS浓度>85%，细胞活力(台盼蓝染色)>95%。将收集的细胞用70%乙醇固定24h。上机前用生理 盐水洗涤1次，加红色(PI)工作液避光15min后，上流式细胞仪检测。
1.2.6 统计学分析 实验数据用ˉx±s表示，组间比较用样本均数t检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 BALF中IL-12、IL-4的浓度
2.1.1 IL-12的浓度 与A组(8.043±2.680)pg/ml比较，B组(5.482±2.080)pg/ml降低，但差异无显著性，C组(11.296±2.058)pg/ml升高，差异有显著性;与B组比较，C组约为B组的2倍，差异有显著性。
2.1.2 IL-4的浓度 与A组(7.383±2.145)pg/ml比较，B组(26.478±4.820)pg/ml约为A组3～4倍，C组(19.794±2.130)约为A组2～3倍，差异均有显著性;与B组比较，C组较B组低，两组差异有显著性。见表1。
表1 各组大鼠模型BALF中IL-12、IL-4的浓度 (略)
注:与A组比较， △ P>0.05， ▲ P<005， ★ P<0.001;与B组比较， ■ P<0.001，P<0.02
2.2 BALF中的炎症细胞总数、EOS数和EOS凋亡率 与A组比较，B组炎症细胞总数约为A组12～13倍，EOS数约为A组7～8倍，EOS凋亡率约为A组1/2，差异均有显著性;C组炎症细胞总数约为A组6倍，EOS数约为A组4～5倍，EOS凋亡率约为A组2倍，差异均有显著性。与B组比较，C组EOS数、炎症细胞总数均降低，约为B组的1/2，EOS凋亡率升高，约为B组4倍，差异均有显著性。见表2和图1～3。
表2 BALF中炎症细胞总数、EOS数和EOS 凋亡率 (略)
注:与A组比较， △ P<0.001， ▲ P<0.05， ☆ P<0.005;与B组比较，P<0.005， ■ P<0.05， ● P<0.001
2.3 BALF中IL-4、IL-12与EOS数、EOS凋亡率的相关性 与A组比较，B组中IL-12的浓度与EOS凋亡率均降低，EOS数与IL-4均升高;C组中IL-12、IL-4、EOS数、EOS凋亡率均升高;与B组比较，C组中IL-12的浓度与EOS凋亡率均升高，EOS数与IL-4均降低。三组中IL-12与EOS数无相关性(r=-0.20，P>0.05)，IL-12与EOS凋亡率有相关性(r=0.75，P<0.001);IL-4与EOS数有相关性(r=0.76，P<0.001;IL-4与EOS凋亡率无相关性(r=039，P>0.05)。见图4，图5。
3 讨论
Th1/Th2平衡是机体行使防御、自身稳定和免疫监视的重要机制。近年来大量资料证实Th1/Th2比例下降与哮喘密切相关。目前证明IL-12与IL-4是与哮喘有关的细胞因子，在哮喘发病中起重要作用。IL-4能促进Th0分化为Th2，同时促进Th2分泌IL-5、IL-13等炎症促进因子，间接抑制Th1分泌IFN-γ、IL-2等炎症抑制因子，合成IgE，而且诱导血管内皮细胞(VEC)表达CC型趋化因子-3(eotaxin-3)，后者与EOS表面CCR3结合，EOS受eotaxin-3作用迁移至炎症中心。IL-12是Th1分泌的一种炎症抑制因子，也是Th0向Th1分化的重要诱导因子，通过抑制CCK3，从而抑制骨髓细胞CD34 + 分化形成EOS，又抑制Th2细胞免疫应答来降低IL-4和IgE的浓度。国外资料认为 [6] :IL-12作为关键性调节细胞因子，对遗传性过敏症和哮喘患者起重要作用。IL-12的浓度降低，引发IgE反应，导致哮喘发生;增加IL-12的浓度能抑制上述过程。本实验研究发现，哮喘组IL-4浓度较对照组升高3～4倍，与陈萍等 [7] 报道的结果相似;IL-12浓度较对照组降低，细胞总数、EOS数显著升高，EOS凋亡率约为对照组的1/4。提示致敏原致敏激发后，哮喘动物模型气道中存在Th1/Th2失衡，机体以Th2免疫应答占优势，间接抑制Th1免疫应答，从而使Th2分泌的炎症促进因子(如IL-4)增多，Th1分泌的炎症抑制因子(如IL-12)减少，EOS凋亡率降低，气道出现大量的炎症细胞(如EOS)。近年来对卡介菌的一系列研究发现，卡介菌的DNA提取物(MY-1)刺激人外周血细胞，发现外周血细胞表面物质中IL-8升高，且IL-8能拮抗对IgE诱导 [8，9] 。BCG-PSN为BCG的衍生物，具有很强的非特异性免疫刺激作用。本研究发现哮喘大鼠模型BALF中，反映气道炎症的细胞总数和EOS数在BCG-PSN干预组较对照组升高，但比哮喘组明显降低;反映Th2功能的炎症促进因子(如IL-4)在BCG-PSN干预组较对照组升高，但比哮喘组明显降低;反映Th1功能的炎症抑制因子(如IL-12)在BCG-PSN干预组较对照组和哮喘组均升高。但是，BCG-PSN干预组和哮喘组比较，IL-12上升的幅度比BCG-PSN干预组和对照组上升的幅度更有意义，与国外文献报道的结果相似 [10] ;更有意义的是，BCG-PSN干预组EOS凋亡率约为对照组的2倍，约为哮喘组的4倍， 且IL-12与EOS凋亡率有相关性(r=0.75，P<0.001)，而与EOS数无相关性(r=-0.20，P>0.05);IL-4与EOS数有相关性(r=0.76，P<0.001)，而与EOS凋亡率无相关性(r=039，P>0.05)。分析其原因，可能是:(1)BCG-PSN在一定程度上纠正哮喘大鼠气道Th1/Th2(如IL-12/IL-4)失衡，使炎症抑制因子分泌增加，炎症促进因子分泌减少，从而抑制气道变态性炎症。(2)BCG-PSN通过上调炎症抑制因子(如IL-12)的浓度，下调炎症促进因子的浓度来启动哮喘大鼠模型EOS凋亡机制，使气道中EOS凋亡增加，间接抑制气道EOS生存，从而抑制气道变态性炎症。BCG-PSN如何启动EOS凋亡，目前报道不多，值得进一步探讨。总之，BCG-PSN作为非特异性调节剂，用于防治哮喘具有良好的前景。
更多关于科技前沿的文章
(http://disease.sina.com/xiaochuan/kjqy/2012-02-06/145913.html)责任编辑：王博